В 30 км к югу от Осло: рыбные клетки вместо живых рыб для исследований инфекционных заболеваний, политика 3R стимулирует трансформацию аквакультурных экспериментов

Норвежская индустрия атлантического лосося в настоящее время производит около 1,5 млн тонн лосося в год, и, по мере роста мирового спроса на морепродукты, эта цифра, как ожидается, будет увеличиваться. Однако поддержание такого объёма производства требует совместных усилий научного сообщества и промышленности для решения одной из крупнейших проблем аквакультуры: инфекционных заболеваний и паразитов. Вспышки болезней угрожают благополучию рыб, наносят значительный экономический ущерб и могут ставить под угрозу окружающие экосистемы и популяции диких рыб.

На протяжении десятилетий исследователи частного сектора проводили тщательно спланированные «испытания с заражением»: живых рыб заражали патогенами, чтобы изучать развитие болезни, проверять эффективность вакцин и отбирать следующее поколение рыб с более высокой или более низкой устойчивостью к заболеваниям. Менеджер по генетике Mowi Genetics Мэтт Барански (Matt Baranski) отметил, что испытания с заражением всегда были краеугольным камнем программ селекции лосося и незаменимым инструментом селекционного отбора на устойчивость к болезням, благополучие рыб и общую устойчивость производства. Глобальный менеджер по НИОКР AquaGen Томас Моэн (Thomas Moen) добавил, что современные испытания с заражением проводятся под строгим регулированием, направленным на защиту благополучия рыб, и уже помогли отрасли весьма эффективно бороться с конкретными заболеваниями, значительно снизив годовую смертность.

Тем не менее преднамеренное подвергание большого количества рыб воздействию вредных или потенциально смертельных инфекционных заболеваний по-прежнему вызывает обеспокоенность по поводу благополучия животных. Растущее внимание общественности вместе с действующим законодательством подталкивают аквакультурную отрасль к более активному внедрению «принципа 3R», а именно замены (Replace), сокращения (Reduce) и совершенствования (Refine) использования лабораторных животных. Принцип 3R, впервые сформулированный в 1959 году, в настоящее время закреплён в качестве исполнимой исследовательской политики (директива ЕС 2010/63/EU) и принят Европейским парламентом и Советом ЕС. Недавнее решение норвежского правительства учредить Национальный центр 3R при Норвежском управлении по безопасности пищевых продуктов подчёркивает рост внимания на политическом и общественном уровне к сокращению зависимости от экспериментов на животных. Для аквакультуры это означает необходимость ускоренной разработки альтернатив крупномасштабным испытаниям с заражением.

В настоящее время исследователи работают над разработкой альтернативных методов, способных дополнить, а в некоторых случаях и заменить эксперименты на живых рыбах. Один из таких подходов — замена живых рыб культивируемыми в лаборатории рыбными клетками: заражая клетки патогенами, исследователи могут изучать связь между генетикой, биологией и устойчивостью рыб к заболеваниям без использования большого количества живых животных. Это сходно с исследовательским подходом для многих других видов (включая человека), где исследования на клеточных культурах уже принесли прорывные открытия. В Норвегии несколько учреждений продвигают переход к 3R на основе клеточных культур.

Кампус в Осе, расположенный примерно в 30 км к югу от Осло, является местом расположения Норвежского университета естественных наук (NMBU), Норвежского ветеринарного института (NVI) и Nofima; здесь реализуется несколько проектов, исследующих способы сокращения зависимости аквакультурных исследований от живых рыб. В рамках проекта PETRI-FISH разрабатываются лабораторные методы для внесения единичных, точных изменений в ДНК культивируемых в лаборатории клеток атлантического лосося. Руководитель проекта, профессор NMBU Мэтью Кент (Matthew Kent), рассказал, что команда использует передовой метод редактирования ДНК под названием CRISPR-скрининг для создания генетического разнообразия: после обработки сотни тысяч рыбных клеток каждая несёт уникальные генетические изменения, которые могут влиять на биологические процессы; затем эти клетки подвергают воздействию инфекционного вируса и наблюдают, какие изменения позволяют клеткам выжить при инфекции. По словам Кента, такие скрининговые методы способны быстро выявить связи между ДНК рыб и биологическими реакциями, такими как способность противостоять инфекции, что может дать новые мишени для селекционных программ.

Второй проект CELLCRISP использует аналогичную технологию CRISPR для тестирования меньших наборов генов, предварительно признанных потенциально важными для таких признаков, как рост и устойчивость к заболеваниям. Руководитель проекта, Торстейн Тенгс (Torstein Tengs) из Nofima, рассказал, что команда применяет CRISPR в различных рыбных клеточных линиях в зависимости от изучаемого признака: например, клетки кожи используются для изучения взаимодействий «хозяин—патоген» или заживления ран, а адипоциты — для изучения признаков, связанных с отложением жира и качеством филе. Тенгс отметил, что ключевым достижением стала возможность проверять гены, представляющие интерес, без редактирования оплодотворённых икринок или умерщвления живых рыб, однако для изучения большего числа признаков требуется больше созданных клеточных линий, которых у рыб зачастую не хватает по сравнению с другими видами.

Разработка и валидация этих клеточных линий — ещё одна часть работы, ведущейся в кампусе в Осе. NVI уже разработал несколько клеточных линий, включая клетки кожи и мышечные клетки, а также эпителиальные клетки жабр ASG-10. Последние уже использовались в рамках проекта GILLMODEL для изучения толерантности жабр атлантического лосося к токсинам, микропластику, качеству воды и инфекционным агентам, а в рамках проекта BIO-DIRECT подготовлены для функциональных геномных исследований, включая редактирование генов. Руководитель проекта BIO-DIRECT Мария К. Дале (Maria K Dahle) отметила, что успешная работа по 3R в значительной степени зависит от создания клеточных моделей, действительно отражающих ситуацию в организме живой рыбы; клетки перед использованием нуждаются в тщательной валидации. По её словам, при создании подходящих альтернативных клеточных моделей нет коротких путей, но при хорошо выполненной предварительной работе они становятся превосходными инструментами.

Расширение применения клеточных методов требует дополнительной исследовательской инфраструктуры и сотрудничества. Профессор NMBU Сигбьёрн Лиен (Sigbjørn Lien) отметил, что в кампусе в Осе есть несколько предложенных инициатив, направленных на развитие таких возможностей. По его словам, ряд захватывающих технологических модернизаций изменит текущие возможности CRISPR-скрининга, разработки рыбных клеточных линий и измерения ключевых признаков клеток; команда работает над привлечением финансирования для завершения этих модернизаций. Лиен также упомянул предложенный проект центра передового опыта Blue Shield, который объединит экспертизу в области геномики рыб, иммунологии, вирусологии и патогенеза заболеваний. По его словам, это углубит понимание связей между геномикой рыб, взаимодействиями «хозяин—патоген» и устойчивостью к заболеваниям, одновременно сокращая зависимость от испытаний с заражением и усиливая способность улучшать исходы заболеваний.

Многие участники отрасли позитивно оценивают потенциал лабораторных методов в борьбе с инфекционными заболеваниями в аквакультуре. Судя по текущей структуре проектов, альтернативный путь не означает немедленной замены испытаний на живых рыбах, а постепенное сокращение зависимости: PETRI-FISH и CELLCRISP сосредоточены на генетическом скрининге, GILLMODEL и BIO-DIRECT — на валидации клеточных моделей и функциональных геномных исследованиях, а проект центра передового опыта Blue Shield находится на стадии предложения и привлечения финансирования.